构建基因敲除的细胞系（构建基因敲除的细胞系有哪些方法）

本文目录一览：

• 1、同源敲除突变体的构建方法
• 2、有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除吗交流下
• 3、【手把手教你发高分文章】5步法教你构建KO细胞系
• 4、cre_loxp基因敲除系统解读
• 5、怎样构建基因敲除小鼠模???
• 6、完全性基因敲除、基因敲入(点突变)鼠如何建系?

同源敲除突变体的构建方法

1、流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。

2、基因敲除技术，即是可以针对一个 DNA 碱基序列已知但功能未知的基因，通过抑制该基因的表达，分析突变体表型变化后来确定该基因的功能。

3、根据整合方式的不同可分为定点整合和随机整合，按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。

4、分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 （中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。1953年沃森、克里克提出DNA分子的双螺旋结构模型是分子生物学诞生的标志。

5、为了确定CRISPR在体细胞中造成的易位频率事件，我们通过农杆菌介导的浸花方法对col0植株中的CRISPR构建物进行了转化，并选择生长两周后的植株为初代转化子。设置了6个生物重复，每个重复收集100株植物用于提取基因组DNA。

6、构建突变体K？rasv12的siRNA病毒载体转染CAPAN？1细胞亦能抑制细胞克隆生长，并阻止裸鼠肿瘤的形成；而对照组细胞生长良好并产生克隆，体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤，因此证明了该siRNA具有明显的特异性和抑制肿瘤生长的作用。

有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除吗交流下

1、基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。分为完全基因敲除和条件基因敲除。基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。

2、CRISPR-Cas9的广泛应用：基因敲除（Knock-out）Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。

3、CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。

4、所以存活的细胞意味着没有敲除必需基因，随着细胞的增值，整合到其基因组上的sgRNA大量富集，我们最终测到了这些sgRNA，但其靶向的基因敲除了并不影响细胞生长，所以这些基因不是目的基因。

5、肯定可以。已有这样的论文报道了，而且还很新的，2014年1月28日发表的。

6、依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。

【手把手教你发高分文章】5步法教你构建KO细胞系

1、当构建好敲除细胞系之后，就需要对特定基因编辑进行充分验证，这是KO实验的最后一步了，也是最令人期待的一步。验证细胞KO是否成功需要对敲除细胞进行表征并确保工作的下游可行性。

2、让大家看一眼原始的图片，并明确下此行目的：将当前界面红色阳性的区域的表面积计算出来（你也可以计算明场细胞的面积，细胞核的面积等等）。

cre_loxp基因敲除系统解读

在loxp与第一个FRT 位点间一般是需敲除基因的外显子，使用cre-loxp 系统就能把两个loxp 间的片段全部删除。

条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。

cre-loxp的条件敲除是系统所开展的组织特异性敲除。基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。

Cre和Flox是与基因工程相关的术语，通常用于实验室中对小鼠进行基因编辑和研究。Cre小鼠：Cre小鼠是指携带Cre重组酶基因的小鼠模型。Cre酶是一种由细菌产生的酶，能够催化DNA重组过程中的特定位点切割。

利用Cre/LoxP系统成功构建了TIGR、OPTN基因时空特异性打靶载体，为进一步构建TIGR、OPTN基因时空特异性基因敲除小鼠奠定基础。

具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。条件型基因敲除：例：Cre/LoxP和FLP/FRT 系统所开展的组织特异性敲除。优点：可以防止完全基因敲除导致胚胎死亡。

怎样构建基因敲除小鼠模???

1、一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。

2、构建基因敲除小鼠模型需要根据构建需求来构建。基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

3、方法 PCR方法扩增两条同源臂，将两条用于同源重组的片段插入XpPNT载体，构建OPG基因敲除打靶载体。

4、传统的有药物、饮食诱导或手术方式构建，另外也有通过基因编辑的方式来构建，包括基因敲除小鼠、基因敲入小鼠、点突变小鼠、人源化修饰小鼠等等。鉴定方式可以通过qPCR验证、测序或蛋白鉴定等。大大满足了目前的研究需求。

5、基因敲除小鼠的原理是利用胚胎对基因进行改造，其方法就是胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养。

6、转基因小鼠模型建立后可以做医学、生物、生化方面的研究。

完全性基因敲除、基因敲入(点突变)鼠如何建系?

1、完全性基因敲除、基因敲入（点突变）鼠可以根据实验性质建系。基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。

2、应用：基因敲除细胞系建立、基因敲除建立动物疾病模型。技术优势：相较于在mRNA水平“敲低”目的基因的RNAi而言，CRISPR/Cas9系统造成基因序列的缺失，从而能完全沉默（即敲除）目的基因。

3、现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

4、是指在基因序列里插入两个flox位点，当与cre小鼠杂交后激活flox位点从而敲掉两个flox之间的那一段基因。

5、CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。